БАДАН

АНАЛИЗ АРБУТИНА ПОДЗЕМНЫХ И НАДЗЕМНЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ ОРГАНОВ БАДАНА ТОЛСТОЛИСТНОГО (BERGENIA CRASSIFOLIA L. FITSCH.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО НА АЛТАЕ Л.М. Федосеева Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул

Цель работы.

Анализ арбутина корневищ, зеленых, красных и бурых листьев бадана толстолистного.

В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной, высокоэффективной жидкостной хроматографии, фотоэлектроколориметрического и спектрофотометрического определения проведена идентификация и установлено количественное содержание арбутина, которое составило:

• в корневищах 6,46%
• зеленых листьях – 15,53%
• красных – 7,69%
• бурых – 4,43%.

Введение.

Бадан толстолистный – вечнозеленый травянистый многолетник, высота 10–60 см, с мощным ветвистым горизонтальным мясистым корневищем, имеющем 1–2 см в поперечнике, длина до 2 м, густо покрыто, особенно в верхней части, остатками черешков отмерших листьев.

Верхушка корневища и его ветвей дает ежегодную розетку листьев и один цветоносный стебель.

Листья в количестве от 1 до 12 – прикорневые, длинночерешковые, кожистые, на верхней стороне блестящие, на нижней стороне с точечными железками. Они широкоэллиптические или почти округлые, при основании сердцевидные, край редко зубчатый; длина листовой пластины 3–35 см, ширина 2,5–30 см [1]. Поскольку бадан развивается несколько лет, на одном растении находятся бурые, красные и зеленые листья.

Бадан толстолистный – одно из немногих растений, содержащих комплекс фенольных соединений, значительное количество которого составляет арбутин (до 22%) [2].

Арбутин – n-гидроксифенил-D глюкопиранозидон, является фенологликозидом [3].

Первые сведения о природе арбутина появились в 1762 г., когда Модел выделил химически чистое и фармакологически активное вещество из листьев толокнянки. Из бадана арбутин впервые выделен А.Е. Чичибабиным с сотрудниками в 1931 г., где он содержится в свободном состоянии, а в листьях толокнянки и брусники в виде метиларбутина [4].

Арбутин представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 199–200° С, растворяется в воде и этиловом спирте, не растворяется в этиловом эфире, хлороформе [3].

Как все фенольные гликозиды, арбутин оптически активен в связи с присутствием в молекуле глюкозы. Арбутин – О-гликозид, характеризуется способностью к ферментативному и кислотному гидролизу, при сухой перегонке расщепляется на гидрохинон и глюкозу [5].

Целью настоящей работы является качественное и количественное определение арбутина в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана толстолистного.

Объектом исследований служило сырье, собранное в республике Алтай в 1996–2001 гг.

Экспериментальная часть.

Для идентификации арбутина использовали цветные реакции, хроматографические методы анализа. Качественный анализ арбутина проводили с водными вытяжками из сырья. В качестве контроля использовали раствор арбутина-стандарта (РСО). ГФ Х1 издания ст. 26 «Листья толокнянки» регламентирует реакции на арбутин с сульфатом закисного железа и фосфорномолибденокислым натрием [6].

Реакции взаимодействия арбутина с сульфатом закисного железа и натрия фосфорномолибденокислым имеют недостатки, так как соли железа образуют комплексные соединения с полифенолами, а содержание в бадане дубильных веществ мешает определению арбутина. Изучалась возможность проведения реакций до и после осаждения полифенолов ацетатом свинца.

Кроме фармакопейных реакций, предложены реакции образования антипиринового красителя (с 4-аминоантипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин.

Образование красителей связано с наличием в молекуле арбутина фенольного гидроксила [7–9]. Хроматография на бумаге водных извлечений осуществлялась восходящим методом на быстро фильтрующей бумаге марки «Filtrak» и FN-3 типа медленная и быстрая; хроматография в тонком слое сорбента – на пластинках «Silufol» в системах растворителей:

1 – раствор уксусной кислоты 15%,

2 –раствор уксусной кислоты 60%,

3 – этилацетат – муравьиная кислота – вода (3 : 1 : 1).

Последующую идентификацию арбутина осуществляли, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию и спетрофотометрию. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые извлечения пропускали через колонку с оксидом алюминия ΙΙ степени активности. Измеряли спектры элюата на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».

Количественное определение арбутина проводили йодометрическим методом титрования [6], фотоэлектроколориметрическим методом, в основе которого лежит реакция образования азокрасителя с диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий) [7], cпектрофотометрическим методом,
основанном на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя [10–12].

Обсуждение результатов. 

В результате эксперимента установлено, что сульфат железа (ΙΙ) с испытуемыми растворами до осаждения полифенольных соединений давал черно-синюю окраску, аналогично гидролизуемым дубильным веществам. После осаждения образовалась голубая окраска растворов, как и у арбутина-стандарта. Натрий фосфорномолибденовокислый давал синюю окраску испытуемых растворов до и после осаждения полифенолов.

Проводились реакции образования антипиринового красителя (с 4-амино-антипирином) и азокрасителя (с реактивом Паули) как качественные реакции на арбутин.

Определена чувствительность реакций для обнаружения арбутина в лекарственном сырье. Готовили серию стандартных разведений с концентрацией от 300 до 12,5 мкг/мл. Из данных которой следует, что чувствительность реакции с натрий фосфорномолибденовокислым составила 12,5 мкг/мл, с 4-аминоантипирином – 25 мкг/мл, с реактивом Паули – 50 мкг/мл. Наибольшей чувствительностью обладала реакция с натрием форфорномолибденовокислым.

В результате хроматографирования на бумаге в видимом свете пятен исследуемого вещества и «свидетеля» не обнаружено. В УФ-свете пятна бледно-фиолетового цвета. Значения Rf рассчитывали после проявления хроматограмм реактивом Паули – красные пятна. Проявляющиеся пятна исследуемого
вещества и «свидетеля» по цвету и значениям Rf совпадали. В системе уксусная кислота 15% Rf =0,87; уксусная кислота 60% Rf = 0,84; этилацетат – муравьиная кислота – вода (3 : 1 : 1) Rf = 0,90 – самое высокое значение. Эта система растворителей обладала хорошей разделяющей способностью и
воспроизводимостью результатов.

В результате проведения хроматографии в тонком слое сорбента в Уф-свете наблюдали фиолетовую флуоресценцию пятен на пластинах в системе: 60% уксусная кислота. Хроматограмму проявляли реактивом Паули. Зона вещества исследуемых извлечений и арбутина- стандарта совпали, величина Rf = 0,88±0,01. В системе 1 и 3 разделение веществ не происходило.

Наличие в молекуле арбутина остатка гидрохинона с достаточной сопряженной системой предполагает поглощение света определенной длины волны с максимумом поглощения при λ = 220 в УФ-области, поэтому для идентификции арбутина использовали спектрофотометрические методы.

Предварительно водное извлечение освобождали от примесей. Для очистки от сопутствующих и балластных веществ исследуемые извлечения через колонку с оксидом алюминия ΙΙ степени активности. Измеряли спектры элюата и арбутина-свидетеля на спектрофотометре СФ-26 и хроматографе «Милихром».
В результате получили спектры исследуемых элюатов и раствора арбутина-свидетеля, идентичные по конфигурации кривой и положению максимумов и минимумов. Для УФ-спектра арбутина характерно два максимума поглощения при λ = 220 и 284 нм. По данным литературы для спектра арбутина характерен максимум поглощения при λ = 220 нм [11]. Нами подтверждено наличие двух максимумов поглощения арбутина в УФ-области с помощью ВЭЖХ и спектрофотометрии. Для количественного определения арбутина ГФ Х1 (ст. 26 «Листья толокнянки») рекомендует йодометрический метод титрования [6].

Листья и корневища бадана помимо арбутина содержат свободный гидрохинон, дубильные вещества, флавоноиды, аскорбиновую кислоту. Мы полагаем, что йодометрическое определение арбутина бадана малоспецифично, поскольку после осаждения полифенольных соединений основным ацетатом свинца в извлечении остаются вещества, способные легко окисляться йодом (гидрохинон, катехины, аскорбиновая кислота и др.).

При титровании арбутина раствором йода точка эквивалентности устанавливается визуально по изменению окраски индикатора, что может привести к ошибке. Кроме того, фармакопейный метод определения арбутина длителен (занимает около 5 ч).
С учетом изложенного проведены исследования возможности применения для количественного определения арбутина бадана физико-химических методов.

Фотоэлектроколориметрический метод. В основе лежит реакция образования азокрасителя после взаимодействия арбутина с диазотированным сульфаниламидом (сульфацил-натрий).
Количественное содержание арбутина определяли по калибровочному графику, для построения которого использовали от 0.6 до 4,2 мл 0,03% водного раствора арбутина. Подчиненность закону Бугера-Ламберга-Бера отмечалась в диапазоне концентраций арбутина 7,9–19,8 мкг/мл. Нижним пределом обнаружения арбутина является концентрация 6,3 мкг/мл.

В методике рекомендовано проводить осаждение полифенолов раствором свинца ацетата основного.

Определены потери арбутина, которые составили около 1,5%. Таким образом, очистка извлечения от сопутствующих полифенольных соединений раствором свинца ацетата основного влечет потери арбутина, что сказывается на результатах количественного определения фотоколориметрическим методом.

Спектрофотометрический метод основан на измерении оптической плотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя.

Методика была модифицирована: 0,5 г (т.н.) измельченного сырья помещали в колбу, приливали 50 мл воды и кипятили в течение 30 мин. После охлаждения фильтровали в мерную колбу на 100 мл. Извлечение повторяли. Объединенные вытяжки доводили водой до метки 2,5 мл раствора переносили в делительную воронку, разбавляли водой до 25 мл, прибавляли 0,3 мл 2% водного раствора 4-аминоантипирина, 1 мл аммиака, 1 мл 2% водного раствора калия феррицианида. Окрашенный продукт извлекали 10 мл хлороформа. Хлороформную вытяжку процеживали в мерную колбу на 25 мл. Операцию повторяли дважды. Объединенные хлороформные растворы доводили хлороформом до метки и измеряли оптическую плотность окрашенного продукта на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 455 нм.

Результаты количественного определения арбутина в зеленых листьях бадана по методике ГФ Х1 издания, фотоэлектроколориметрическим и спектрофотометрическим методами представлены в таблице 6, из данных которой следует, что наименьшую относительную ошибку давал спектрофотометрический метод определения арбутина 3,71%, который характеризуется точностью и простотой выполнения.

Фотоэлектроколориметрический метод давал относительную ошибку 6,54% в связи с тем, что в методике предусмотрено осаждение сопутствующих полифенольных соединений, что приводило к соосаждению и арбутина. Йодометрический метод давал завышенные результаты вследствие неспецифичности используемой реакции.

Рекомендуем для количественного определения арбутина в сырье бадана спектрофотометрический метод. В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина:

в зеленых листьях составило 15,53±0,39%,

красных – 7,69±0,15%,

бурых – 4,43±0,17%

корневищах – 6,46±0,14%.

Выводы. В результате проведенных исследований на основании цветных реакций, бумажной, тонкослойной и высокоэффективной хроматографии, спектрофотометического метода определения в корневищах, зеленых, красных и бурых листьях бадана идентифицирован арбутин.

Модифицированы методики качественного и количественного определения арбутина в бадане толстолистном. ,Модифицирована и доказана целесообразность количественного определения арбутина в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом.

В результате спектрофотометрического определения содержание арбутина:

в зеленых листьях составило 15,53±0,39%,

красных – 7,69±0,15%,

бурых – 4,43±0,17%,

корневищах – 6,46±0,14%.

Список литературы:

1. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения (Растения-целители). 3-е изд. М., 1984. 400 с.
2. Шнякина Г.П., Седельникова В.А., Цыганкова Н.Б. О содержании арбутина в листьях некоторых растений Советского Дальнего Востока // Раст. ресурсы. 1981. Т. 17. Вып. 4. С. 568–571.
3. Краткая химическая энциклопедия. М., 1961. Т. 1. 645 с.
4. Чичибабин А.Е. Недубильные вещества экстракта корневищ бадана. Арбутин // Серия А. М.,1930. С. 23.
5. Иванов И.И. Ферментативное расщепление арбутина // Методы физиологии и биохими растений. М.; Л.,1946. С. 243–246.
6. Государственная фармакопея. 11-е изд. М., 1990. Вып. 2. 398 с.
7. Браиловская В.А., Лукьянчикова Г.И. Фотоколориметрическое определение арбутина в листьях толокнянки //Фармация. 1972. №3. С. 31–32.
8. Федосеева Л.М., Малолеткина Т.С. Выделение некоторых фенольных соединений и идентификация арбутина зеленых листьев бадана // Химия растительного сырья. 1999. №3 С. 109–111.
9. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Качественное определение арбутина в листьях бадана //Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 189–196.
10. Горбунцова Н.М., Федосеева Л.М., Горбикова О.А. Количественное определение арбутина в листьях бадана //Актуальные проблемы фармации: Сб. науч. тр. Барнаул, 1995. С. 196–199.
11. Китанов Г. Содержание арбутина в Arctostaphylos uva ursi из разных районов НРБ // Растит. ресурсы. 1986.№3. С. 425–428.
12. Pearl I.A., Darling S.F. Spectrometry as an aid for determining structures ol naturall glucosides // Phytochem. 1989.Vol. 7. №5. P. 831–836.