АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ ИЗ BERGENIA CRASSIFOLIA

 2023.02.05

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ ИЗ BERGENIA CRASSIFOLIA (L.) FRITSCH. И VACCINIUM VITIS-IDAEAE L. IN VITRO П.Б. Лубсандоржиева Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ

Изучена антиоксидантная активность (АОА) извлечений из Bergenia crassifolia (L.) Fritsch. и Vaccinium vitis-idaeae L. Установлено, что наибольший вклад в суммарную АОА извлечений вносят дубильные вещества и флавоноиды. Присутствие арбутина в экстрактах в высоких концентрациях существенного влияния на суммарную АОА извлечений не оказывает.

Введение. 

Корни, черные (перезимовавшие) листья Bergenia crassifolia (L.) Fritsch, листья Vaccinium vitis-idaeae L. входят в состав разработанных нами 2 гепатопротекторных и 1 гиполипидемического сборов, показавших в экспериментах на животных выраженную антиоксидантную активность (АОА) [1–3].

Опыты in vitro дали следующий результат: отвары листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. и V. vitis-idaeae L. имеют наибольшие значения АОА по сравнению с другими компонентами сборов [4].

Цель данной работы – оценить антиоксидантную активность извлечений из корней и листьев B. crassifolia (L.) Fritsch., листьев V. vitis-idaeae L. in vitro.

Экспериментальная часть. 

Собранные в Прибайкальском районе Республики Бурятия (хребет Улан-Бургасы) в весенне-осенний период 2002–2003 гг. и высушенные листья (зеленые и черные) B. crassifolia (L.) Fritsch. и V. vitis-idaeae L. измельчали до размера частиц 2 мм, экстрагировали соответствующими растворителями в соотношении сырье : экстрагент – 1:10, растворитель удаляли, экстракт высушивали в вакуум-сушильном шкафу.

Выход экстрактов от массы сырья составляет:

  • из зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. при 3-кратной экстракции 60%-ным этанолом – 40,5% (экстракт №1);
  • из черных, перезимовавших листьев при 3-кратной экстракции 60%-ным этанолом – 16,2% (экстракт №2); при 1-кратной экстракции водой – 36,0% (экстракт №3);
  • из корней B. crassifolia (L.) Fritsch. при 1-кратной экстракции кипящей водой – 33,0% (экстракт №4);
  • из листьев V. vitis-idaeae L. при 1-кратной экстракции кипящей водой – 38,0% (экстракт №5).

50 г сухого экстракта зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. растворили при нагревании в 500 мл дистиллированной воды, затем обработали хлороформом до осветления раствора, водный остаток обработали этилацетатом 5-кратно по 200 мл. Этилацетат отогнали в роторном испарителе, сухой остаток досушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход фракции – 16,0% от исходной массы экстракта (экстракт №6).

Водный остаток после удаления липофильных веществ обработали 200 мл н-бутанола, обработку повторили четырежды. Бутанол отогнали на роторном испарителе в азеотропной смеси с водой, сухой остаток досушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход фракции – 28% от исходной массы экстракта (экстракт №7). 20 г экстракта №5 V. vitis idaeae L. растворили в 500 мл дистиллированной воды, добавили 40 мл 10%-ного раствора ацетата свинца, колбу с содержимым выдерживали на кипящей водяной бане до полной коагуляции осадка. Горячую жидкость отфильтровали, концентрировали, высушили в вакуум-сушильном шкафу. Выход полученного экстракта – 42,6% от исходной массы экстракта (экстракт №8). Количественное содержание дубильных веществ в пересчете на таннин, антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дишлюкозид, флавоноидов в пересчете на рутин определяли по методике ГФ [5].

Хроматоспектрофотометрическое определение арбутина. 0,1 г (точная навеска) экстракта растворяли в 100 мл 40%-ного этилового спирта. 2,0 г окиси алюминия, промытого дистиллированной водой до нейтральной реакции, помещали в стеклянную колонку диаметром 1,5 см и высотой 25 см, промывали 10 мл дистиллированной воды, затем 10 мл 40%-ного этилового спирта. 1 мл экстракта помещали в колонку с окисью алюминия и элюировали 25 мл 40%-ного этилового спирта. Элюат собрали в мерную колбу вместимостью 25 мл, довели объем раствора до метки 40%-ным этиловым спиртом (раствор А).

Оптическую плотность раствора А измеряли на спектрофотометре при длине волны 285 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 40%-ный этиловый спирт, пропущенный через колонку с окисью алюминия. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора арбутина, предварительно полученного из зеленых листьев бадана. Приготовление раствора арбутина. 0,05 г (точная навеска) высушенного при 75 оС арбутина растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки 40%-ным этиловым спиртом. 1 мл раствора арбутина помещали на колонку с окисью алюминия и элюировали 25 мл 40%-ного этанола. Получение образца арбутина. 50 г высушенных и измельченных зеленых листьев бадана с влажностью 6%, содержанием арбутина 18,7% поместили в колбу вместимостью 1 л, добавили 500 мл воды дистиллированной, экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником при температуре 90 °С в течение 1 ч.

Экстракцию повторили в тех же условиях. 830 мл извлечения (плотность 1,007 г/см3) сепарировали для очистки от балластных веществ. Очищенный экстракт упарили до объема 300 мл, добавили 25 мл 10%-ного раствора ацетата свинца, нагревали на водяной бане до полной коагуляции осадка, затем отфильтровали. Объем очищенного экстракта – 260 мл, упарили досуха, сухой остаток экстрагировали 50 мл 95%-ного этилового спирта на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Экстракцию повторили дважды в тех же условиях. Спиртовые извлечения объединили, растворитель отогнали на роторном испарителе, к оставшемуся маслянистому остатку прилили 50 мл смеси хлороформ-этанол (1,2 : 1), экстрагировали на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин.

Экстракцию повторили дважды в тех же условиях. 150 мл извлечения охладили, оставили на 24 ч. Получены тонкие игольчатые кристаллы арбутина белого цвета – 2,029 г. Арбутин перекристаллизовали из смеси хлороформ-этанол (1,2:1), выход чистого арбутина – 84%, т. пл. 164–167 °С, УФ-спектр (С2Н5ОН), λmax, нм: 285. ИК-спектр, νmax, см–1: 3346 (OH), 1634, 1513 (C=C), 1215, 1100, 831, 817. Для изучения антиоксидантной активности in vitro использована модельная система, представляющая собой суспензию желточных липопротеидов. АОА извлечений определяли по способности тормозить накопление продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в суспензии желточных липопротеидов со спектрофотометрическим детектированием при 532 нм [6]. Величину АОА выражали в С Ѕ, (г/л)–1 – концентрация экстракта, необходимая для ингибирования образования малонового диальдегида (МДА) на 50%.

Обсуждение результатов.

Результаты количественного определения фенольных соединений в извлечениях из листьев и корней бадана, брусники и их суммарной АОА показывают, что наибольшей АОА из изученных фенольных комплексов листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. обладает этилацетатная фракция, очищенная от липофильных и водорастворимых веществ, в том числе арбутина. Экстракт №6 подавляет образование МДА более эффективно, чем исходный экстракт №1, причем различия более значимы в малых дозах экстрактов: в дозе 0,03–0,04 мг/мл – на 20–27%, 0,08–0,1 мг/мл – на 10%. В этидацетатной фракции содержатся среднеполярные фенольные вещества (флавоноиды, фенолокислоты, антоцианы и др.) [7], обладающие высокой АОА по литературным данным [8–10].

Содержание фенольных соединений и антиоксидантная активность извлечений из B. crassifolia (L.) Fritsch. и V. vitis-idaeae L Наименование, Содержание фенольных соединений*, % № АОА, С Ѕ, (г/л)–1 дубильные вещества флавоноиды антоцианы арбутин

Экстракт 1 40 32,20 3,88 0,62 38,84

Экстракт 2 38 22,02 5,41 2,46 10,63

Экстракт 3 45 27,21 1,10 0,09 10,70

Экстракт 4 11 41,06 – 0,03 29,40

Экстракт 5 29 7,05 3,63 0,93 7,31

Экстракт 6 50 87,08 4,40 0,48

Экстракт 7 33 27,82 1,48 0,13 48,40

Экстракт 8 26 28,33 1,42 0,98 32,81

Примечание: прочерк означает, что вещества не обнаружены; * – среднее из трех определений.

Результаты опытов показывают, что присутствие арбутина незначительно влияет на АОА извлечений. Фракция фенологликозидов V. vitis idaeae L (экстракт №8) имеет сопоставимую АОА с водным экстрактом, при этом содержание арбутина в экстракте №8 в 4,5 раза больше, чем в экстракте ОБР №5. Известно, что в эксперименте in vivo арбутин оказывал меньшую антирадикальную активность на модели с супероксидным и гидроксильным радикалом по сравнению с суммарным экстрактом V. vitis idaeae L, содержащим такое же количество арбутина [11].

Снижение суммарной АОА экстрактов, содержащих арбутин, очевидно, обусловлено образованием посредством водородной связи неактивных в обрыве цепей окисления ассоциатов арбутина с пероксильными радикалами [12]. Таким образом, арбутин, несмотря на высокое содержание в изученных экстрактах, не вносит существенный вклад в их суммарную АОА, что согласуется с литературными данными.

Наиболее существенный вклад в суммарную АОА экстрактов вносят полифенолы и флавоноиды. Во флавоноидный состав листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. входят рутин, кверцетин, дигидрокверцетин [7], V. vitis-idaeae L. – кемпферол, кверцитрин, рутин, авикулярин, производные лютеолина [13]. Кверцетин, кемпферол, рутин, лютеолин обладают высокой АОА, в которую большой вклад вносит 3',4'-дигидроксифенильная группировка кольца В [10, 14]. АОА флавоноидов напрямую связана с количеством гидроксильных групп в их структуре, и с их способностью выступать в качестве восстановителя по отношению к свободным радикалам с образованием более стабильных флавоксильных радикалов, что приводит к ограничению инициации или обрыву цепной реакции свободнорадикального окисления [8, 14]. Данные опытов позволяют также сделать вывод, что наибольший вклад в суммарную АОА экстрактов вносят водорастворимые полифенольные вещества извлечений. Так, АОА экстракта №2, несмотря на более высокое содержание флавоноидов, сопоставимое количество полифенолов, меньше таковой водного экстракта №3 на 16%.

Основным компонентом водорастворимых полифенолов черных листьев B. crassifolia (L.) Fritsch. является галловая кислота [7], обладающая АОА на разных моделях окисления, сопоставимой с активностью признанного антиоксиданта – аскорбиновой кислоты [15]. АОА экстрактов V. vitis-idaeae L обеспечивают также водорастворимые таннины, спектр АОА которых довольно широк: циннамтаннин В-1 оказывал сильнейшую активность при перекисном окислении липидов; проантоцианидин А-1 – сильнейшую супероксид радикалперехватывающую активность; производное эпикатехина – сильное ингибирующее действие на процесс образования супероксида [16]. Выводы Таким образом, основной вклад в суммарную АОА экстрактов бадана и брусники вносят фенольные соединения. Наибольшей АОА обладает этилацетатная фракция экстракта зеленых листьев B. crassifolia (L.) Fritsch, содержащая дубильные вещества и флавоноиды. Присутствие арбутина в экстрактах в высоких концентрациях существенного влияния на суммарную АОА извлечений не оказывает.

Список литературы:

  1. Лубсандоржиева П.Б., Дашинамжилов Ж.Б., Николаев С.М., Диль А.А. Разработка многокомпонентных сборов для лечения алкогольного гепатита на основе рецептуры традиционной медицины // Традиционная медицина.Восток–Запад. 2005. Т. 2. №4 (8). С. 43–49.48
  2. Патент 2171679 (Россия). Лекарственный сбор, обладающий гиполипидемическим и адаптогенным свойствами/ Николаев С.М., Лубсандоржиева П.Б., Найданова Э.Б. и др. // Опубл. 10.08.2001. Бюл. №22.
  3. Патент 2178706 (Россия). Лекарственный сбор для профилактики и лечения алкогольного абстинентного синдрома и алкогольного гепатита / Николаев С.М., Найданов С.А., Дашинамжилов Ж.Б., Лубсандоржиева П.Б. и др. // Опубл. 27.01.2002. Бюл. №3.
  4. Лубсандоржиева П.Б., Дашинамжилов Ж.Б., Унагаева А.А. Сравнительная оценка антиоксидантной активности гепатопротекторных сборов и их компонентов in vitro: Мат. науч.-практ. конф., посв. 75-летию Э.Г. Базарона. Улан-Удэ, 2006. С. 67–68.
  5. Государственная фармакопея. ХI изд. М., 1987. Вып. 2. 340 с.
  6. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкина Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лабораторное дело. 1988. №5. С. 59–62.
  7. Лубсандоржиева П.Б. Бадан толстолистный. Серия «Лекарственные растения тибетской медицины». Улан-Удэ,2003. 90 с.
  8. Foti M., Piatteli M., Baratta M.T., Rubetto G. Flavonoids, coumarins, and cinnamic acids as antioxidants in a micellar system. Structure – activity relationship // J. Agric. Food Chem. 1996. V. 44. P. 487–501.
  9. Kong J.-M., Chia L.-S., Goh N.-K., Chia T.-F., Brouillard R. Analysis and biological activities of anthocyanins // Phytochemistry.2003. V. 64. №5. P. 923–933.
  10. Vinson J.A., Dabbagh Y.A., Serry M.M., Jang J. Plant flavonoids, especially tea flavonols, are powerful antioxidants using an in vitro oxidation model for heart disease // J. Agric. Food Chem. 1996. V. 43. P. 2800–2802.
  11. Myagmar B.E., Shinno E., Ichiba T., Aniya Y. Antioxidant activity of medicinal herb Rhodococcum vitis-idaea on galactosamineinduced liver injury in rats // Phytomedicine. 2004. V. 11. №3. P. 416–423.
  12. Ковтун Г.А., Плужников В.А., Пилявский П.С. и др. Эффективность обрыва цепей окисления метилового эфира олеиновой кислоты природным фенологликозидом – арбутином // Доп. нац. АН Украины. 1995. №4. С.88–89.
  13. Васильев И.Б. Разработка технологии и норм качества жидкого и сухого экстракта листьев брусники: Автореф.дис. … канд. фарм. наук. Пятигорск, 1997. 21 с.
  14. Arora A., Nair M.G., Strasburg G.M. Structure-activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system // Free Radical Biology and Medicine. 1998. V. 24. №9. P. 1355–1363.
  15. Aniya Y., Miyagi C., Nakandakari A., Kamiya S., Imaizumi N., Ichiba T. Free radical scavenging action of the medicinal herb Limonium wrightii from the Okinawa islands // Phytomedicine. 2002. V. 9. №2. P. 239–244.
  16. Ho K.Y., Huang J.S., Tsai C.C., Lin T.S., Hsu Y.F., Lin C.C. Antioxidant activity of tannin components from Vaccinium vitis-idaea L. // J. Pharm. and Pharmacol. 1999. V. 51. №9. P. 1075–1078.